激光共聚焦顯微鏡利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測,來自光源的光通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上,該點所發射的熒光成像在探測針孔上,該點以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的,因此被探測點即共焦點,被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上,為了產生一幅完整的圖像,由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描,從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動,將樣品新的一個層面移動到共焦平面上,樣品的新層面又成像在顯示器上,隨著Z軸的不斷移動,就可得到樣品不同層面連續的光切圖像。
激光共聚焦顯微鏡具有出色靈活性的流線型光路,使用少的光元件獲得高靈敏度。熒光發射光穿過具有出色激光抑制性能的主二色分光鏡來提供更佳圖像對比度。使用多達兩個擁有的可變次級二色分光(VSD)來對熒光發射光信號進行光譜分光。能夠連續監測和校正掃描器的位置,以確保穩定平整的觀察視野及在整個觀察范圍內保持恒定的像素曝光時間。這項獲得的線性掃描方式可以在整個掃描區域內(包含待操作的感興趣區域)實現恒定信噪比和均勻曝光。
高速光活化成像,由于非共振掃描器和共振掃描器集成在一個單元里,不需要另配獨立的用來做光活化的激光器,光活化和熒光成像就可以同時進行。擁有可以高速成像的共振掃描器使得光活化后快速變化信號的獲取成為可能。